Un tres

npj Biofilms and Microbiomes volumen 9, número de artículo: 57 (2023) Citar este artículo

2065 Accesos

18 altmétrica

Detalles de métricas

La gran cantidad de factores de estrés que pueden dañar las células microbianas ha desarrollado mecanismos sofisticados de respuesta al estrés. Si bien los bioinformadores existentes pueden monitorear las respuestas individuales, todavía faltan sensores para detectar respuestas de estrés multimodal en microorganismos vivos. Las proteínas fluorescentes rojas, verdes y azules detectables ortogonalmente combinadas en un único plásmido, denominado informador RGB-S, permiten un análisis simultáneo, independiente y en tiempo real de la respuesta transcripcional de Escherichia coli utilizando tres promotores que informan sobre el estrés fisiológico (PosmY para RpoS). ), genotoxicidad (PsulA para SOS) y citotoxicidad (PgrpE para RpoH). El bioinformador es compatible con el análisis estándar y la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) combinado con el análisis del transcriptoma posterior. Varios factores estresantes, incluido el 2-propanol biotecnológicamente relevante, activan una, dos o las tres respuestas al estrés, lo que puede afectar significativamente las vías metabólicas no relacionadas con el estrés. Implementado en cultivo de microfluidos con imágenes de microscopía de fluorescencia confocal, el reportero RGB-S permitió el análisis espaciotemporal de biopelículas vivas que revelan subpoblaciones estratificadas de bacterias con respuestas heterogéneas al estrés.

La comprensión de cómo los microorganismos median los cambios adaptativos para asegurar la supervivencia en condiciones ambientales cambiantes requiere el seguimiento de las correspondientes vías de respuesta al estrés. RpoS, SOS y RpoH son vías críticas de respuesta al estrés que modulan las vías transcripcionales a través de un amplio espectro de estímulos de estrés, con implicaciones para la formación y proliferación de biopelículas1,2, la virulencia de patógenos3, la resistencia a los antibióticos4, la evolución4 y la competencia ecológica5. RpoS es un factor sigma alternativo que regula, directa e indirectamente, alrededor de 500 genes en Escherichia coli (E. coli)6. Conocida como respuesta general al estrés, la activación de RpoS es estimulada principalmente por la inanición como indicador de estrés fisiológico7. La respuesta SOS, por otro lado, comprende más de 50 genes que desempeñan varias funciones en respuesta al daño del ADN inducido por agentes químicos, físicos o biológicos8. Por lo tanto, la regulación positiva de la respuesta SOS está asociada con la genotoxicidad celular. El factor sigma alternativo RpoH es el regulador clave de la respuesta al estrés por choque térmico en E. coli y abarca más de 30 genes9,10. La activación de la respuesta RpoH es estimulada por la acumulación de proteínas desplegadas en la célula como indicación de citotoxicidad.

En vista de la gran relevancia de estos procesos biológicos para la tecnología y la medicina, una comprensión integral de los mecanismos moleculares subyacentes es de suma importancia. Por ejemplo, monitorear las respuestas celulares a múltiples factores estresantes puede hacer una contribución importante para comprender la viabilidad y productividad celular11, como la inhibición de productos, la privación de nutrientes, el pH o el estrés cortante12, así como para monitorear una variedad de tóxicos ambientales, como herbicidas o antibióticos13. Por lo tanto, un análisis multimodal de la respuesta al estrés microbiano sería importante no sólo para la investigación básica sino también para los procesos biotecnológicos.

Con este objetivo, se han desarrollado varios biosensores bacterianos codificados genéticamente12,13,14,15,16,17,18. Los elementos indicadores comúnmente utilizados son los indicadores colorimétricos de β-galactosidasa (lacZ)15 y bioluminiscencia (luc, lux)16. Dado que estos sistemas generalmente requieren lisis celular, ensayos de múltiples pasos o reacciones catalíticas que limitan la medición en línea y los informes multicolores, se han desarrollado reporteros basados ​​en fluorescencia para el análisis de la respuesta al estrés17,18. Sin embargo, los sistemas actualmente disponibles carecen de la capacidad de informar la respuesta multimodal de células vivas con alta resolución espaciotemporal. Aquí describimos un biosensor fluorescente de tres colores codificado genéticamente que muestra simultáneamente la respuesta bacteriana al estrés fisiológico, la genotoxicidad y la citotoxicidad mediante el monitoreo de las vías de respuesta al estrés correspondientes (Fig. 1 y Fig. 1 complementaria).

La activación de las vías de respuesta al estrés RpoS, SOS y RpoH conduce a la expresión de proteínas fluorescentes rojas, verdes y azules, respectivamente, como lo indican las imágenes de microscopía de fluorescencia. La barra de escala es de 50 µm.

Para realizar un indicador de respuesta al estrés multicolor y robusto con altas relaciones señal-ruido, se seleccionaron tres promotores del organismo modelo E. coli K12 MG1566: PsulA es un promotor fuertemente inducido durante la respuesta SOS que indica daño en el ADN (genotoxicidad). 19, y PosmY del regulón RpoS es un indicador de falta de nutrientes, estrés osmótico y otros estreses fisiológicos20. El promotor chaperón PgrpE participa en la respuesta RpoH al choque térmico, que se activa debido a la acumulación intracelular de proteínas desplegadas que son indicativas de citotoxicidad16,21. Se seleccionaron tres variantes de proteína fluorescente (FP) detectables ortogonalmente con colores rojo (mRFP1) 22, verde (GFPmut3b) 23 y azul (mTagBFP2) 24 para permitir lecturas simultáneas de la activación de la vía (Tabla complementaria 1). Las secuencias codificantes de los tres FP se optimizaron para altas tasas de traducción de proteínas25 en E. coli para asegurar señales adecuadas incluso en condiciones de inhibición del crecimiento. Dado que la síntesis y maduración de FP desempeñan un papel importante en el inicio de la señal de fluorescencia26, utilizamos las proteínas fluorescentes mejoradas GFPmut3b23 y mRFP122 que maduran más rápido que los ancestros nativos. Al fusionar los FP aguas abajo de los promotores, el indicador RGB-S completamente ensamblado (para el indicador de estrés rojo, verde y azul) contenía los elementos genéticos de PosmY::mRFP1 para indicación de estrés fisiológico, PsulA::GFPmut3b para genotoxicidad y PgrpE: :mTagBFP2 para citotoxicidad (Figura 1 complementaria). Para evitar artefactos de lectura traslacional de un elemento informador a los demás, se agregaron terminadores transcripcionales estrictos entre los elementos sensores, lo que resultó en una respuesta activada individualmente de los elementos sensores aislados (Figura 1 complementaria). Los casetes del biosensor tribble se clonaron en un esqueleto de plásmido de copias múltiples y se mantuvieron mediante selección con kanamicina.

Para verificar inicialmente la especificidad y solidez del reportero RGB-S tanto en análisis de microscopía como en mediciones cuantitativas en masa, se comparó su rendimiento con sistemas publicados anteriormente. Para ello, E. coli transformada con el reportero RGB-S fue expuesta al herbicida glifosato. Como se esperaba, se produjo una regulación positiva de la respuesta al hambre, lo que resultó en una expresión sustancial de la proteína fluorescente roja (RFP) (Fig. 2a). Asimismo, la presencia del antibiótico ácido nalidíxico (NA), que interfiere con la ADN girasa para alterar la fidelidad del ADN e inducir una respuesta SOS28, desencadenó la expresión esperada de la proteína verde fluorescente (GFP). En particular, las imágenes de fluorescencia también permitieron la identificación de morfologías celulares únicas, como la filamentación celular. Este fenotipo es característico de la respuesta SOS en etapa tardía y fue claramente visible en el canal GFP de las células expuestas a NA (Fig. 2a) o ciprofloxacina (Fig. 2 complementaria). El tratamiento de las células con metanol, que se sabe que afecta la permeabilidad de la membrana además de otros modos de acción citotóxicos, condujo a la inducción de una señal significativa de proteína fluorescente azul (BFP) (Fig. 2a). Sin embargo, el cambio observado para BFP es menor que para las otras dos proteínas fluorescentes, probablemente porque la citotoxicidad indicada por el sensor informa eventos de plegamiento incorrecto, que también podrían afectar a la propia BFP. Además del análisis de microscopía, la respuesta del informador RGB-S a las tensiones también podría monitorearse en cultivos masivos para permitir una evaluación cuantitativa detallada de la cinética y la dependencia de la dosis del tratamiento farmacológico (Fig. 2b y Fig. complementaria 3). El tratamiento de E. coli que alberga el indicador RGB-S (RGB-S E. coli) con dosis definidas de factores estresantes mostró claramente el aumento esperado dependiente de la dosis de la señal fluorescente correspondiente a lo largo del tiempo. En particular, los resultados más precisos para la mayoría de los factores estresantes se pueden adquirir durante las primeras cinco horas mientras las células crecen activamente, después de lo cual se pueden observar lecturas estocásticas debido a las señales de estrés acumuladas e interferidas en las células envejecidas (Figura complementaria 4). Además, verificamos la estabilidad del plásmido en presencia y ausencia de selección de kanamicina durante ensayos de estrés prolongado. Descubrimos que la ausencia de selección de kanamicina no afectó la estabilidad del plásmido informador RGB-S en cultivos diluidos y envejecidos (Figura complementaria 5). Sin embargo, se observó una disminución general de la señal de fluorescencia específica en el cultivo diluido, lo que indica una posible disminución del número de copias del plásmido debido a la división celular continua (Figuras complementarias 5c, d).

a Imágenes de microscopía de fluorescencia de E. coli planctónica que alberga un reportero RGB-S expuesto a diversos factores estresantes durante 5 horas. La barra de escala es de 50 µm. b Las lecturas cuantitativas correspondientes de la placa de microtitulación, que se muestran como barras, indican el cambio en veces (FC) de la fluorescencia específica (FU/OD600) con respecto a los controles que portaban el sensor pero no estaban sujetos a un factor estresante. Las barras de error son la desviación estándar (DE) de seis réplicas biológicas. (*) prueba y control muestran diferencia significativa (p ≤ 0,05), evaluado mediante Prueba T de Muestras Independientes. c Las mediciones a lo largo del tiempo de la respuesta específica de fluorescencia roja, verde y azul al glifosato (RFP), al ácido nalidíxico (GFP) y al metanol (BFP), respectivamente, ilustran la dependencia de la respuesta al estrés de la dosis del factor estresante y el tiempo de exposición. RFU, GFU y BFU se refieren a unidades de fluorescencia roja, verde y azul, respectivamente. Las barras de error son la desviación estándar (DE) de seis réplicas biológicas. Tenga en cuenta que las principales respuestas observadas mediante imágenes microscópicas en a se correlacionan claramente con las evaluaciones cuantitativas realizadas por el lector de placas en b y c.

Además, el reportero RGB-S reveló respuestas móviles en tiempo real. Por ejemplo, el daño al ADN inducido por NA es acumulativo debido a la exposición continua a NA en el medio, lo que conduce a un aumento exponencial de la señal de GFP con el tiempo (Fig. 2b). Por el contrario, una breve estimulación mediante irradiación UV provocó un aumento de la señal GFP (respuesta SOS debido al daño del ADN) que alcanzó su pico entre 45 y 75 minutos después del estímulo, seguido de una disminución de la señal probablemente debido a la reparación del daño o la dilución de la señal. por crecimiento celular (Figura complementaria 3b). Estos análisis detallados de los mecanismos de acción de las sustancias tóxicas para las células son difíciles de lograr con los sensores convencionales.

La capacidad de observar las respuestas en tiempo real reveló variaciones en el inicio de la señal debido a la diferente activación del regulón tras el empleo de factores estresantes variables. Por ejemplo, encontramos que las células expuestas al glifosato responden mediante fluorescencia RFP en 15 minutos, mientras que la exposición al dodecilsulfato de sodio (SDS) produjo intensidades de señal similares solo después de un retraso de 4 horas (Figura complementaria 6).

Luego utilizamos el RGB-S E. coli para la comparación directa de los efectos monomodales y multimodales de varios factores estresantes medidos cuantitativamente mediante un lector de placas de fluorescencia (Fig. 3a y Fig. complementaria 7) y cualitativamente mediante microscopía de fluorescencia (Fig. 3b, cy Figura complementaria 2). Descubrimos que el reportero RGB-S identificó correctamente los principales modos de acción, que habían sido determinados previamente por otros medios (Fig. 3a)16,19,27,28,31,32,33,34,35,36. Por ejemplo, algunos antibióticos y la irradiación UV fueron altamente específicos para inducir la fluorescencia de GFP, lo que se correlaciona con su potencial genotóxico debido al daño del ADN (Fig. 3a)19,28,31. El glifosato también mostró un cambio altamente específico en la expresión de RFP (RpoS) debido a su inhibición de la vía del shikimato a través de la 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa, interfiriendo así con muchas vías metabólicas27.

a Respuesta multimodal de RGB-S E. coli a inductores de estrés representados como cambios en veces (FC) de la señal de fluorescencia en relación con los controles no estresados. Las barras de error son la desviación estándar (DE) de seis réplicas biológicas. (*) prueba y control muestran diferencia significativa (p ≤ 0.05), evaluada mediante Prueba T de Muestras Independientes para medias normales y Prueba U de Mann-Whitney para medias no normales. Para el hambre, la importancia se determinó mediante la prueba T de muestras pareadas. Los cultivos que contenían el plásmido indicador se incubaron durante 5 h en medio Luria-Bertani suplementado con kanamicina (LB+kan), excepto la inanición que se realizó durante 9 días. b Análisis de la respuesta heterogénica a nivel unicelular al 2-propanol al 2% (v/v) determinado mediante análisis microscópico después de 5 h de incubación. La barra de escala es de 25 µm. c Imágenes representativas (obtenidas de b) que muestran células que muestran una respuesta única, multimodal o ninguna respuesta al estrés. La barra de escala es de 5 µm. Los colores rojo, verde y azul indican estrés fisiológico, genotoxicidad y citotoxicidad, respectivamente.

Además de identificar correctamente el principal regulón de respuesta conocido, el reportero de RGB-S proporcionó información sobre los mecanismos moleculares desencadenados por factores estresantes, que inducen más de un regulón de respuesta. Por ejemplo, en caso de inanición se observó una respuesta bimodal de RFP y GFP (Fig. 3a). Si bien se esperaba la fluorescencia de RFP debido a la conocida inducción de RpoS tras la inanición33, la respuesta asociada de GFP (SOS) de 3,5 veces se puede atribuir a la mutagénesis en fase estacionaria37. Además, como tendencia general, observamos una respuesta triple modal para los compuestos que inducen BFP (citotoxicidad), como el etanol, el 2-propanol o la acetona (Fig. 3a y Fig. 7 complementaria). La expresión de BFP es indicativa de la acumulación de proteínas mal plegadas que, a su vez, pueden afectar funciones vitales de los componentes celulares. Esto explica por qué las señales RFP y GFP suelen estar asociadas con la respuesta BFP. Por otro lado, no se observó la correlación inversa.

Luego se utilizó la capacidad de respuesta multimodal del informador RGB-S para un análisis detallado a nivel de una sola célula mediante análisis de imágenes microscópicas (Fig. 3b, c), a partir del cual se puede deducir eficientemente el alcance relativo de cada respuesta (Fig. 8 complementaria). ). Se descubrió que la multimodalidad se basa en respuestas heterogénicas de subpoblaciones, que reaccionan ante un factor estresante determinado de maneras claramente diferentes. Por ejemplo, después de la adición de 2-propanol, las células podrían asignarse a cuatro categorías que muestren una respuesta mono, dual, triple o sin estrés (Fig. 3c). Las células sin respuesta al estrés podrían ser células muertas, por lo que han cerrado la transcripción, o células que han perdido el plásmido sensor. Se obtuvieron resultados heterogénicos similares de otros factores estresantes, como el fenol y el butanol (Figura complementaria 9). Si bien la heterogeneidad fenotípica es un fenómeno bien descrito atribuido a la dinámica inherente a las células, los efectos estocásticos transcripcionales y otros factores ecológicos38,39, el análisis detallado de estos procesos sigue siendo difícil. En este contexto, el reportero RGB-S puede dilucidar las bases moleculares de tales fenómenos al permitir la identificación y separación de subpoblaciones individuales utilizando tecnologías establecidas como la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS).

Para demostrar este enfoque, clasificamos aproximadamente 1 millón de células de E. coli RGB-S tratadas con 2-propanol al 2% (v/v) en dos réplicas basadas en las respuestas de células individuales en cuatro subpoblaciones (mono RFP, mono GFP, doble RFP-GFP y triple RFP-GFP-BFP) utilizando FACS (Figura complementaria 10). Se realizó un análisis transcriptómico para determinar los cambios relativos en los niveles de ARNm (Fig. 4 y Fig. 11 complementaria). Como era de esperar, las respuestas mono y dual revelaron una regulación positiva en sus respectivas regiones de estrés. En subpoblaciones con respuesta mono GFP, la transcripción de los genes SOS estaba regulada positivamente, incluidos los genes recA y lexA, que se conocen como los principales reguladores SOS (Fig. 4a). Asimismo, el gen osmY informado por RpoS mostró una transcripción predominante tanto en las subpoblaciones mono RFP como en las subpoblaciones duales RFP-GFP (Fig. 4b). En las subpoblaciones duales RFP-GFP, tanto el gen SOS, sulA, como el gen regulador, lexA, mostraron altos niveles de transcripción. Estos resultados confirmaron el análisis fenotípico del reportero RGB-S.

Las células RGB-S E. coli se trataron con 2-propanol al 2% (v/v) y se clasificaron mediante FACS. Las poblaciones se clasificaron según las respuestas de las células individuales en cuatro subpoblaciones, mono GFP, mono RFP, RFP-GFP dual y RFP-GFP-BFP triple, con números (1, 2) que indican réplicas. Se analizaron genes transcritos diferencialmente implicados en las vías de respuesta al estrés SOS (a), RpoS (b) y RpoH (c) dentro de las cuatro subpoblaciones ordenadas. d Análisis de vías metabólicas transcritas diferencialmente según lo anotado en la base de datos KEGG de las cuatro subpoblaciones clasificadas.

Sin embargo, inesperadamente, las subpoblaciones RFP-GFP-BFP mostraron una regulación negativa en la transcripción del gen grpE informado por RpoH, así como de los genes involucrados en las respuestas SOS y RpoS (Fig. 4c). Las células de esta población han activado las tres respuestas al estrés analizadas en este estudio y han comenzado a acumular las tres proteínas indicadoras fluorescentes. Sin embargo, el intenso estrés provocado por la activación de varias vías podría provocar que las células interrumpan la transcripción. Entonces, dichas células aún mostrarían una fluorescencia significativa para los tres informadores, pero reducirían los niveles generales de transcripción, lo que en última instancia conduciría a una división celular detenida y, por lo tanto, a proteínas fluorescentes sin diluir. Esta hipótesis está respaldada por el bajo perfil de transcripción del regulón RpoH observado en las células de respuesta triple (Figura 11 complementaria). Los resultados sugieren que se necesitan estudios más profundos dependientes del tiempo y de la dosis de dichas subpoblaciones para dilucidar el perfil transcripcional detallado del regulón RpoH ante los factores estresantes.

Curiosamente, el análisis del transcriptoma de las subpoblaciones clasificadas reveló otros perfiles transcripcionales alterados por el factor estresante además de las vías de señalización de la respuesta al estrés, como lo muestra en particular el análisis de enriquecimiento de las vías metabólicas de la Enciclopedia de genes y genomas de Kyoto (KEGG) 40 (Fig. 4d). Por ejemplo, se demostró que los metabolismos de la biosíntesis de lipopolisacáridos, purina y piruvato estaban regulados positivamente en las poblaciones que respondieron a mono GFP, mientras que los metabolismos de fructosa, alanina y cisteína estaban regulados positivamente en las poblaciones duales RFP-GFP (Fig. 4d). Estos primeros nuevos hallazgos sobre la modulación de tales vías metabólicas ya demuestran claramente el enorme potencial del nuevo enfoque para la identificación de efectos desconocidos inducidos por el estrés, que podría ser aplicable para el diseño racional de cepas de producción y otras aplicaciones en biología sintética. La exploración de estas nuevas interacciones puede dilucidarse aún más mediante la aplicación de métodos de biología de sistemas41. Al aprovechar los conjuntos de datos transcriptómicos obtenidos de diversas condiciones de estrés combinados con el análisis del reportero RGB-S en estudios adicionales, los investigadores pueden revelar las intrincadas interrelaciones entre las respuestas al estrés informadas, así como otras vías no relacionadas con el estrés.

La heterogeneidad fenotípica también es una característica distintiva de las biopelículas bacterianas39, que son importantes tanto en ecología como en entornos médicos y biotecnológicos42,43. Para investigar las biopelículas vivas de E. coli, empleamos una configuración de celda de flujo de microfluidos44 que permite el análisis in situ no disruptivo de RGB-S E. coli mediante microscopía de barrido láser confocal (CLSM) (Fig. 5a, b y Fig. complementaria. 12). El análisis de imágenes de biopelículas maduras, cultivadas durante 96 horas en ausencia de factores estresantes, generalmente reveló señales que se originan en unas pocas células fluorescentes que ocurren al azar en ubicaciones en el centro del canal de microfluidos (Fig. 5b, "centro"). Sin embargo, en lugares específicos, como en el borde del canal fluídico donde el perfil de flujo conduce a la biomasa acumulada, se observaron patrones distintivos de células fluorescentes (Fig. 5b, "borde"). Por ejemplo, con frecuencia se observó una expresión notable de GFP en grupos de células agregadas. Además, a menudo se observó una mayor expresión de RFP en las células cerca del fondo de la biopelícula, presumiblemente indicativo de la limitación de nutrientes en los microambientes respectivos.

Una ilustración esquemática del canal de flujo utilizado para el cultivo y la obtención de imágenes en tiempo real de una biopelícula viva de E. coli RGB-S cultivada bajo un flujo continuo de 10 µl/min LB+kan. Se indican las posiciones “centro” y “borde”. b Una biopelícula madura cultivada durante 96 h muestra principalmente una respuesta heterogénica baja causada por la aparición aleatoria de células individuales estresadas (fila superior). Cerca del borde del canal de flujo (fila inferior), las células que expresan GFP dominan la parte superior de la biopelícula, mientras que las células que expresan RFP se acumulan en la parte inferior. La barra de escala es de 100 µm para las vistas superior e inferior y de 25 µm para las vistas laterales. c Después de hacer crecer la biopelícula durante 96 h, solo se puede observar una señal de fondo basal detectada en las posiciones centrales (sin estrés, I) que indica el estado normal de la biopelícula sin estrés particular. Después del tratamiento con ácido nalidíxico durante otras 24 h (NA, II), las células de la biopelícula mostraron una señal elevada de GFP (genotoxicidad). La administración posterior de glifosato (Gly, III) conduce a una disminución de la respuesta de GFP con la aparición concomitante de una respuesta elevada de RFP (estrés fisiológico). Un tratamiento adicional con metanol (MeOH, IV) conduce a la inducción de fuertes señales de BFP (citotoxicidad). La barra de escala es de 100 µm. Las barras cuantitativas rojas, verdes y azules (a la derecha) representan el promedio de intensidad de RFP, GFP y BFP, respectivamente, adquiridos en nueve regiones de 100 µm2. (*) indican significación estadística de las medias de respuesta (p ≤ 0,05), evaluadas mediante ANOVA unidireccional para grupos paramétricos y prueba de Kruskal-Wallis para grupos no paramétricos. Las barras de error representan la desviación estándar (SD). En la figura complementaria 13 se muestran imágenes adicionales de diferentes posiciones centrales. d Organización interna de las tres respuestas al estrés dentro de la biopelícula final tratada con MeOH, fotografiada en una posición central. La biopelícula muestra una fluorescencia azul con una segunda capa fluorescente roja interna y una capa SOS delgada interna final. La barra de escala 3D es de 25 µm.

Es importante destacar que la configuración experimental permitió la perturbación controlada de las biopelículas mediante la administración de factores estresantes distintivos, utilizando condiciones ambientales que de otro modo serían inalteradas, como nutrientes y flujo constantes (Fig. 5c y Fig. 13 complementaria). Por ejemplo, después de una fase de crecimiento inicial de 96 horas sin factor estresante (Fig. 5c, I), la biopelícula madura se expuso secuencialmente al ácido nalidíxico (NA), glifosato (Gly) y metanol (MeOH), respectivamente, cada uno durante 24 horas. horas bajo condiciones de flujo sin cambios. Como se esperaba de los resultados con los cultivos planctónicos descritos anteriormente, la NA provocó un aumento específico en la señal de GFP (SOS), lo que indica daño en el ADN en las células formadoras de biopelículas (Fig. 5c, II). El intercambio de NA genotóxico por el estresante fisiológico Gly no solo indujo la alta señal de RFP esperada, sino que también restauró el estado de GFP sin estrés (Fig. 5c, III). También se observó el mismo efecto al aplicar MeOH como tercer factor estresante, lo que indujo una fuerte respuesta de BFP, junto con señales menores de RFP y GFP (Fig. 5c, IV), similar a la respuesta multimodal observada con las células planctónicas. Estas respuestas de biopelículas documentadas mediante microscopía de fluorescencia confocal se correlacionan claramente con las respuestas cuantitativas medidas por el lector de placas para los respectivos factores estresantes que se muestran en las Figs. 2b, c y 3a. La respuesta dinámica de la biopelícula viva también podría monitorearse en tiempo real (Figura complementaria 14). Estos resultados documentan vívidamente que los mecanismos moleculares de afrontamiento del estrés de las biopelículas responden de manera flexible a los cambios ambientales, lo que, entre otras estrategias de defensa, también debería contribuir a la bien conocida resiliencia inherente de las biopelículas.

La perturbación provocada por factores estresantes también altera la organización tridimensional de la biopelícula viva. Por ejemplo, después de 24 horas de administración de MeOH, toda la estructura de la biopelícula mostró una fluorescencia azul en gran medida homogénea, como se esperaba (Fig. 5d). Sin embargo, un análisis más detallado con los tres colores reveló sorprendentemente un patrón tridimensional distintivo en capas de respuestas al estrés dentro de la biopelícula, lo que indica capas internas con fluorescencia RFP predominante (estrés fisiológico) y una capa GFP (SOS) más delgada en el medio. La heterogeneidad del estrés y la estratificación estructural en las biopelículas se han relacionado con microgradientes de nutrientes, oxígeno y metabolitos42,45. La fluorescencia azul homogénea observada aquí en toda la biopelícula con un espesor estructural promedio de aproximadamente 50 µm sugiere que la difusión de los factores de estrés no estaba restringida en las condiciones utilizadas. Por tanto, la actividad metabólica podría ser la razón de la estratificación observada. Dado que el metabolismo celular consume rápidamente oxígeno, la capa roja media (Fig. 5d) podría deberse a una limitación local de oxígeno y, por lo tanto, representar la zona más estresada fisiológicamente y, por lo tanto, sensible a SOS (verde) de la biopelícula. Se han descrito efectos heterogénicos espaciales similares para biopelículas de Pseudomonas aeruginosa39, donde el consumo de oxígeno por las capas superficiales de la biopelícula podría ser más rápido que su difusión hacia las capas inferiores, lo que conduce a una superficie metabólicamente activa además de capas inferiores gruesas inactivas46. En general, las observaciones realizadas aquí demuestran por primera vez que una biopelícula viva de E. coli en condiciones de flujo continuo responde a nivel celular con una respuesta dinámica y espacialmente localizada a los factores estresantes. Estos resultados subrayan la utilidad de la tecnología presentada aquí y sugieren que una combinación con muestreo resuelto espaciotemporal39,44 y técnicas de secuenciación deberían permitir investigaciones detalladas de los mecanismos moleculares y fisiológicos subyacentes en comunidades microbianas tan complejas.

En conclusión, el reportero RGB-S descrito aquí facilita análisis de estrés múltiple en poblaciones de biopelículas y planctónicos bacterianos, revelando las respuestas de la población al estrés junto con la heterogeneidad de la población y la organización espacial. Dado que las proteínas fluorescentes se acumularán con el tiempo debido a su estabilidad, junto con las fluctuaciones de la señal experimentadas durante mediciones prolongadas, la precisión de la cuantificación relativa en experimentos que duran más de 5 horas puede verse comprometida. Esto podría abordarse en estudios adicionales empleando proteínas informadoras menos estables. Como el presente sistema biosensor está diseñado en un plásmido de copias múltiples para permitir una rápida amplificación de la señal y sensibilidad a bajas concentraciones de factores estresantes, los problemas de estabilidad del plásmido, especialmente en cultivos diluidos, pueden conducir a ensayos sesgados o estocásticos. Se puede investigar un casete de biosensor integrado en el genoma en estudios adicionales para superar estos problemas. Una sugerencia futura adicional es etiquetar la cepa del sensor con una cuarta proteína fluorescente compatible, expresada constitutivamente, que permitirá visualizar y localizar todas las células, especialmente en el espacio 3D de biopelículas heterogénicas, para estimar así la proporción de células estresadas y no estresadas. Dado que el nuevo biosensor es compatible con los modernos sistemas de detección e imágenes de alto rendimiento47, este tipo de biosensores de estrés múltiple permitirán la adquisición de datos de alto contenido para facilitar el análisis rápido, sólido y completo de la respuesta bacteriana a cambios ambientales transitorios y permanentes. . Creemos que este enfoque es de gran valor no sólo para la investigación fundamental en el contexto de la aparición de resistencia a los antibióticos por estrés48 y la heterogeneidad del estrés dentro de las biopelículas42,43, sino también para aplicaciones prácticas en medicina y biotecnología.

El reportero RGB-S se construyó mediante la fusión de tres elementos sensores sintéticos, clonados en la columna vertebral pMK-RQ [kanR & ColE1 ori] (GeneArt® Gene Synthesis, ThermoFisher Scientific e IDT Inc.) (Figura complementaria 1). Cada construcción de detección se compone de tres partes: a) un promotor que responde al estrés, b) una proteína indicadora fluorescente yc) un terminador transcripcional. Con base en el criterio principal de exhibir una respuesta rápida y específica, se seleccionaron promotores que responden al estrés basándose en estudios de la literatura. Las secuencias de los promotores elegidos se obtuvieron a partir de la secuencia del genoma de E. coli str. Sustancia K12. MG1655 (GenBank: U00096.3). Se eligieron proteínas fluorescentes con respecto a su alta intensidad de señal y compatibilidad espectral. Para mejorar sus tasas de traducción, se optimizaron los codones de proteínas fluorescentes seleccionadas para E. coli utilizando el software GeneOptimizer™ (ThermoFisher Scientific)25. Las secuencias de proteínas fluorescentes y los terminadores transcripcionales se obtuvieron de partes bien documentadas del Registro de Partes Biológicas Estándar (parts.igem.org). Las secuencias de todos los elementos genéticos se enumeran en la Tabla complementaria 2. Para el manejo de diseños genéticos in silico, se utilizó el software Geneious 9.1.8 (Biomatters Ltd.). El esqueleto del plásmido contenía el gen de resistencia a la kanamicina (kanR), para el cual se proporcionó kanamicina para selección en todos los caldos y medios de agar (LB+kan) a una concentración final de 50 µg/ml.

El reportero RGB-S se ensambló utilizando la reacción de clonación isotérmica49 Gibson Assembly® Master Mix (NEB inc.) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Si fue necesario, el ADN molde se eliminó mediante tratamiento con DpnI. Se agregaron 1 µl de enzima de restricción sensible a la metilación DpnI y 2 µl de tampón CutSmart® (ambos de NEB inc.) a la reacción ensamblada y se incubaron a 37 °C durante 30 minutos. El producto de reacción se usó para transformar la cepa de clonación de E. coli químicamente competente DH5α (preparación de laboratorio), luego se sembró en placas de agar LB+kan (50 µg/ml) y se incubó durante la noche a 37 °C. Todos los plásmidos se purificaron utilizando ZR Plasmid Miniprep - Classic (Zymo Research inc.) siguiendo el protocolo del fabricante, se verificó la secuencia (genómica LGC) y se almacenaron a -20 °C.

La estrategia general de clonación se muestra en la figura complementaria 1. Después de la construcción inicial del sensor de doble color (llamado reportero RG-S) que consta de PsulA::GFPmut3b::terminator_1 y PosmY::mRFP1::terminator_2, este vector se linealizó usando los cebadores O17051-F y O17052-R y ensamblados con el tercer elemento sensor (terminator_3::PgrpE::mTagBFP2::terminator_4), lo que da como resultado el plásmido final de triple color/detección de estrés llamado reportero RGB-S.

Los productos químicos utilizados en este estudio son: EtOH 96% ANALAR, 1-BuOH ANALAR y 2-propanol grado HPLC de VWR international GmbH. Ácido nalidíxico, ciprofloxacina, dimetilsulfóxido (DMSO) de calidad para cultivo celular, cloranfenicol de calidad para biología molecular, isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG), sulfato de kanamicina, sal sódica de ampicilina y monohidrato de glucosa de PanReac AppliChem. El MeOH y la acetona fueron de grado de análisis, el fenol fue de grado de síntesis, el acetato 100% y el grado de análisis de glicerol de Merck, Darmstadt, Alemania. Glifosato, Roundup® Gran 420 g/kg como sal sódica de Monsanto, Alemania. Grado de electroforesis de dodecilsulfato de sodio (SDS) de BioRad. Fructosa ≥99% de Sigma-Aldrich. Furfural 99% de Acros Organics.

Para los ensayos de detección de estrés, se transformaron células químicamente competentes de E. coli K12 MG1655 DSMZ 18039 de tipo salvaje (DSMZ GmbH, Alemania) con el indicador RGB-S (designado como RGB-S E. coli) y se sembraron en agar LB+kan como se describe. arriba. Se preparó un banco de semillas de criostock de glicerol de E. coli RGB-S utilizando una única colonia pura para minimizar la heterogeneidad fenotípica en los ensayos de estrés. A partir de una placa de agar LB+kan durante la noche, se inocularon varias colonias individuales cada una en 5 ml de caldo LB+kan y se incubaron en un agitador de 180 rpm a 37 °C. De estos cultivos de crecimiento exponencial se almacenaron alícuotas criogénicas de 15% de glicerol a -80 °C. Se utilizó una alícuota nueva para iniciar cada nuevo experimento de ensayo de estrés.

El protocolo de ensayo se diseñó para determinar de manera confiable el estado de estrés del cultivo incluso bajo niveles altos de estrés donde no se producía más crecimiento del cultivo. El ensayo de estrés comenzó usando una alícuota del banco de semillas para inocular dos cultivos independientes (Culto 1 y Culto 2) cada uno en 5 ml de caldo LB+kan y se incubó durante la noche en un agitador de 180 rpm a 37 °C. Al día siguiente, los cultivos se diluyeron a 1:250 usando LB+kan fresco y se incubaron nuevamente en las mismas condiciones durante 5 a 6 horas. Después de alcanzar la densidad óptica adecuada, los cultivos se diluyeron usando LB+kan nuevo para ajustar la DO600 a 0,4, que es 2 veces la densidad celular final en la placa de ensayo. Al mismo tiempo, los agentes químicos estresantes se diluyeron en LB+kan hasta 2 veces la concentración final requerida. El tratamiento de estrés comenzó agregando 250 µl de cultivo de E. coli RGB-S diluido a 250 µl de mezcla de estrés LB (o LB que no contenía ningún factor estresante como cultivo de control) para formar un volumen total de 500 µl, que tenía una densidad celular final de OD600 0,2. y concentración de estresor 1X. Tras mezclar, cada uno de los dos cultivos (Culto 1 y Culto 2) se distribuyó en tres réplicas en una placa de 96 micropocillos, cada pocillo contenía 150 µl. En total, se analizaron seis réplicas biológicas independientes para cada concentración de estrés, a menos que se indique lo contrario. Luego se cubrió la placa de microtitulación con una película transparente compatible con la fluorescencia (Lab Logistics Group Inc.) para evitar la evaporación del cultivo y se incubó en un lector de microplacas Synergy H1 (BioTek Inc.) con agitación orbital continua (282 cpm, 3 mm) a 37ºC. ° C y midiendo la densidad óptica (OD600) y las tres lecturas de fluorescencia en las longitudes de onda que figuran en la Tabla complementaria 1 en los intervalos de tiempo asignados.

Para la irradiación UV se utilizó una lámpara germicida UV-C (Philips UV-C, TUV30W G30T8). La lámpara se encendió durante 30 minutos antes de la irradiación para alcanzar la intensidad máxima de potencia. Se prepararon dos cultivos como se indicó anteriormente y se diluyeron hasta una DO600 de 0,2 usando LB+kan fresco. Se vertió 1 ml de cada cultivo diluido en una placa de Petri estéril de 60 mm para formar un área amplia de capa de cultivo delgada y homogénea y se expuso por duplicado a la luz ultravioleta durante diferentes períodos. Luego, los cultivos irradiados se distribuyeron inmediatamente por triplicado en una placa de microtitulación de 96 pocillos y se incubaron como se describió anteriormente. Los cultivos de control se trataron según el mismo procedimiento pero sin exposición a los rayos UV.

Para obtener imágenes microscópicas 2D, se utilizó un microscopio de fluorescencia invertida ApoTome (Carl Zeiss Inc.). Se cargaron 10 µl de un cultivo tratado con factores estresantes en un portaobjetos de vidrio para microscopio y se cubrieron con un portaobjetos de vidrio y luego se tomaron imágenes utilizando los tres juegos de filtros de luz compatibles correspondientes a las tres proteínas fluorescentes (Juego 43 HE para RFP, Juego 44 para GFP y Juego 49 para BFP) como se indica en la Tabla complementaria 1. Antes de obtener imágenes de los cultivos tratados con factores estresantes, la configuración de adquisición de imágenes se estableció en el blanco utilizando un cultivo de control no estresado. Se tomaron imágenes de los tres canales de fluorescencia para el mismo campo mediante el software AxioVision (Carl Zeiss Inc.) y su intensidad de fluorescencia se mostró en una tabla de búsqueda (LUT) como un gradiente lineal creado por ImageJ50 (imagej.nih.gov/ij).

La estabilidad del plásmido se probó utilizando el mismo protocolo de ensayo de estrés descrito anteriormente, excepto por el volumen de cultivo, que se modificó a 5 ml de cultivos de LB en tubos de cultivo. Para indicar la presencia de plásmido en las células, todos los cultivos se estresaron con 6 µg/ml de ácido nalidíxico como inductor de genotoxicidad indicada por la señal de GFP. Además, la presencia del plásmido se confirmó mediante siembra en placas de agar selectivo con kanamicina. Para los cultivos envejecidos que se muestran en las figuras complementarias 5a, b, se incubaron tres cultivos LB independientes suplementados con la concentración estándar de kanamicina (50 µg/ml, +Kan) y otros tres cultivos sin kanamicina (-Kan) en agitación de 180 rpm a 37 °. C durante tres días. Al inicio del experimento, así como a intervalos de 24 h, se midieron las lecturas de fluorescencia de OD600 y GFP para verificar la presencia de plásmido. Para los cultivos de dilución que se muestran en la figura complementaria 5c, d, se utilizaron procedimientos idénticos, excepto que los cultivos se diluyeron diariamente transfiriendo 20 µl para inocular 5 ml de caldo LB fresco con (+Kan) y sin (-Kan). kanamicina. Las mediciones de densidad óptica y fluorescencia se documentaron al final de cada intervalo, antes de la transferencia del cultivo. Al cuarto día de subcultivo, los cultivos +Kan y -Kan se diluyeron y se sembraron en placas de agar LB+kan, se incubaron a 37 °C durante 24 h, luego las colonias se contaron y representaron en la figura complementaria 5e.

La cepa RGB-S E. coli se trató con 2-propanol al 2% (v/v) durante 5 h a 37 °C en dos cultivos de 500 ml cada uno, utilizando el protocolo de ensayo de estrés estándar descrito anteriormente. Los cultivos no tratados se prepararon en las mismas condiciones que el control. Luego, las células de control se diluyeron con solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1X hasta una concentración aproximada de 1 x 106 células ml-1 y se analizaron en el clasificador de células para establecer el umbral de la señal de fluorescencia de fondo para la clasificación de las muestras tratadas. Posteriormente, las poblaciones de células tratadas con RGB-S E. coli también se diluyeron con PBS y se clasificaron utilizando un clasificador de células de alta velocidad MoFlo XDP (Beckman Coulter) equipado con líneas láser de 405 nm, 488 nm y 561 nm. El análisis posterior a la adquisición se realizó con el software FlowJo (BD Biosciences). Tanto la muestra de control no estresada como las subpoblaciones de mono RFP estresada, mono GFP, RFP-GFP dual, RFP-GFP-BFP triple con señales de fluorescencia de estrés superiores al umbral de fondo de control se ordenaron por duplicado. La selección de las poblaciones antes mencionadas se muestra en la figura complementaria 10. Se clasificaron un millón de células para cada muestra (excepto RFP-2 y RFP-GFP-2, que recibieron 0,7 y 0,75 millones de células, respectivamente) en 250 µl de RNAPure™ peqGOLD. (VWR International GmbH), luego se agitó inmediatamente y se mantuvo en hielo hasta la extracción.

El ARN se extrajo con el kit Direct-zol RNA Miniprep (Zymo Research Inc.), siguiendo el protocolo estándar. Se aplicó tratamiento con ADNasa después de la extracción utilizando el kit TURBO DNA-free™ (Invitrogen) y el ARN se almacenó en 1 µl de inhibidor de ribonucleasa RNasin® (Promega Corporation). El ARN se cuantificó con el kit de ensayo Qubit™ RNA HS (Invitrogen). Inmediatamente, se prepararon bibliotecas de ARN utilizando el kit de biblioteca de ARN total Zymo-Seq RiboFree® (Zymo Research Inc.), con algunas modificaciones. Estos incluyeron extender la incubación de la síntesis de ADNc de la primera cadena a 48 °C a 1,5 horas, mantener el paso de agotamiento de RiboFree® a 2 horas incluso cuando las concentraciones de ARN eran <250 ng, usar RNA Clean & Concentrator-5 (Zymo Research Inc.) para la primera limpieza después del paso de agotamiento de RiboFree® (según el Apéndice E) y la repetición del paso final de limpieza de perlas después de la PCR dos veces para eliminar los dímeros del adaptador. La concentración y el tamaño de la biblioteca se cuantificaron con el kit de ensayo Qubit™ dsDNA HS (Invitrogen) y el kit Bioanalyzer High Sensitivity DNA (Agilent Technologies Inc.). Las bibliotecas de ARN se secuenciaron utilizando un Illumina NextSeq 550 con el kit High Output v2.5 -150 ciclos (2 x 75 pb de extremo emparejado) (Illumina Inc.).

Todas las extracciones de ARN y preparaciones de bibliotecas se realizaron en un banco de trabajo de PCR de flujo laminar (STARLAB International GmbH) descontaminado con RNase AWAY® o DNase AWAY® (Molecular Bio-Products Inc.) y UV.

Se verificó la calidad de las lecturas de secuencia con FastQC v0.11.9 (www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc) y se recortó la calidad con Trim Galore51. Las lecturas de ARNr se eliminaron utilizando SortMeRNA v4.3.4 (bases de datos silva-bac-16s-id90 y silva-bac-23s-id98 como referencia) con la configuración predeterminada52. Las lecturas filtradas se asignaron al genoma de E. coli MG1655 (ASM584v2), editadas para incluir las secuencias de construcción del sensor, con el alineador STAR v2.7.6a53. La alineación de intrones se deshabilitó configurando --alignIntronMax 1, y los pares de lectura se mantuvieron si la puntuación de alineación normalizada en longitud y el número de bases coincidentes normalizadas en longitud eran al menos 0,5. Los recuentos de lectura para cada gen se determinaron utilizando featureCounts54. Los recuentos se normalizaron y los genes transcritos diferencialmente se analizaron (padj = <0,05) con DESeq2 en R v3.6.355,56. El diseño de DESeq2 se estableció para probar la variación entre las cuatro subpoblaciones diferentes de E. coli RGB-S. Como prueba estadística se utilizó la Prueba de Razón de Verosimilitud (LRT). Las muestras de control se utilizaron para calcular los cambios log2 entre todas las muestras, pero no se utilizaron para determinar genes significativos entre las cuatro subpoblaciones. Luego se utilizaron genes significativamente transcritos como entrada para el Análisis de variación del conjunto de genes (GSVA) ​​para determinar las vías enriquecidas de la Enciclopedia de genes y genomas de Kyoto (KEGG)40,57. Aquí, el número mínimo de genes requeridos se estableció en 5.

Para obtener imágenes de biopelículas en 3D, la cepa RGB-S E. coli se cultivó en un chip de microfluidos de celda de flujo recto. La estructura de microfluidos permeable a los gases se fabricó con polidimetilsiloxano elastomérico (PDMS) (Sylgard 184, Down Corning) y se unió a una película de polímero de cicloolefina (COP) (HJ-Bioanalytik GmbH, Alemania) (Figura complementaria 12). La biopelícula se cultivó en el chip montado en la platina de una microscopía de barrido láser confocal (CLSM) (ZEISS LSM 880, Carl Zeiss Inc.) a una temperatura constante de 37 °C y un flujo continuo de LB+kan de 10 µl/min. utilizando una bomba de jeringa Nexus 3000 (Chemyx Inc.). La biopelícula madura inicial se cultivó durante 96 h. Después de la maduración de la biopelícula, se ajustaron los ajustes de adquisición de imágenes para visualizar cada respuesta de estrés basal de acuerdo con la biopelícula de control antes de aplicar los factores estresantes. Después de esta configuración inicial, los parámetros de adquisición se mantuvieron idénticos durante todo el experimento. Se bombeó LB+kan con ácido nalidíxico inductor SOS 6 µg/ml a través del chip al mismo caudal durante 24 h, seguido de LB+kan + glifosato al 2% (p/v) durante 24 h, y por último seguido de metanol 8 % (v/v) durante 24 h. Las imágenes se adquirieron utilizando el software ZEN 2.0 black (Carl Zeiss Inc.) con los espectros de adquisición de fluorescencia que se muestran en la Tabla complementaria 1. Las imágenes de biopelículas en 3D se construyeron utilizando el software ZEN 2.3 Blue Edition (Carl Zeiss Inc.).

Para generar las barras de intensidad de fluorescencia que se muestran en la Fig. 5c y la Fig. 13 complementaria, ZEN 2.3 Blue Edition generó una imagen ortogonal xy 2D que suma las capas de la pila Z para un total de 9 posiciones de campo de visión. Cada campo de visión era un cuadrado de 100 µm2. Estas regiones se utilizaron para calcular la intensidad de fluorescencia integrada (IntDen) para los tres canales utilizando ImageJ.

Para el análisis de los datos se utilizó Microsoft Excel. Se utilizó IBM SPSS Statistics v.24.0 (IBM Inc.) para determinar la significancia estadística. Para las higos. 2b, 3a, 5c y la Fig. 13 complementaria, se utilizaron las pruebas de Kolmogorov-Smirnov y Levene para determinar la normalidad y la homogeneidad, respectivamente. Para la Fig. 5c y la Fig. 13 complementaria, los grupos paramétricos de 3 colores se compararon mediante ANOVA unidireccional seguido de LSD como análisis post hoc, mientras que los grupos no paramétricos se analizaron mediante la prueba de Kruskal-Wallis. Para las higos. 2b y 3a (excepto el experimento de inanición), la importancia de las medias normales independientes se determinó mediante la prueba T de muestras independientes y las medias no normales mediante la prueba U de Mann-Whitney. Para el experimento de inanición en la Fig. 3a, la importancia de las medias normales dependientes se determinó mediante la prueba T de muestras pareadas y las medias no normales mediante la prueba de rangos con signo de Wilcoxon. Todas las pruebas se realizaron con un 95% de confianza (p ≤ 0,05) utilizando seis repeticiones, a menos que se indique lo contrario.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de la naturaleza vinculado a este artículo.

Toda la información genética utilizada o generada a lo largo de este estudio estuvo disponible en la Tabla complementaria 2. Los datos de RNA-seq se enviaron al Gene Expression Omnibus (GEO) del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) con el número de acceso GSE211360. Los materiales y datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles del autor correspondiente previa solicitud razonable.

Gotoh, H., Kasaraneni, N., Devineni, N., Dallo, SF y Weitao, T. Participación de SOS en la formación de biopelículas inducibles por estrés. Bioincrustación 26, 603–611.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Singh, PK y cols. Vibrio cholerae combina la detección individual y colectiva para desencadenar la dispersión de biopelículas. actual. Biol. 27, 3359–3366.e7 (2017).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dong, T. & Schellhorn, HE Papel de RpoS en la virulencia de patógenos. Infectar. Inmune. 78, 887–897 (2010).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Mathieu, A. et al. Descubrimiento y función de una respuesta de estrés hormético central general en E. coli inducida por concentraciones subletales de antibióticos. Representante celular 17, 46–57 (2016).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Cornforth, DM & Foster, KR Detección de competencia: el lado social de las respuestas al estrés bacteriano. Nat. Rev. Microbiol. 11, 285–293 (2013).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Weber, H., Polen, T., Heuveling, J., Wendisch, VF y Hengge, R. Análisis de todo el genoma de la red general de respuesta al estrés en Escherichia coli: genes dependientes de sigmaS, promotores y selectividad del factor sigma. J. Bacteriol. 187, 1591-1603 (2005).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Battesti, A., Majdalani, N. y Gottesman, S. La respuesta al estrés general mediada por RpoS en Escherichia coli. Año. Rev. Microbiol. 65, 189-213 (2011).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Simmons, LA, Foti, JJ, Cohen, SE y Walker, GC La red reguladora SOS. EcoSaltPlus 3, 1–30 (2008).

Artículo de Google Scholar

Straus, DB, Walter, WA y Gross, CA La respuesta al choque térmico de E. coli está regulada por cambios en la concentración de σ32. Naturaleza 329, 348–351 (1987).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Richmond, C. Perfiles de expresión de todo el genoma en Escherichia coli K-12. Ácidos nucleicos res. 27, 3821–3835 (1999).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Aertsen, A. & Michiels, CW Estrés y cómo las bacterias afrontan la muerte y la supervivencia. Crítico. Rev. Microbiol. 30, 263–273 (2004).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Polizzi, KM & Kontoravdi, C. Biosensores codificados genéticamente para monitorear el estrés celular en bioprocesamiento. actual. Opinión. Biotecnología. 31, 50–56 (2015).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Xu, T., Close, DM, Sayler, GS y Ripp, S. Bioinformadores de células completas genéticamente modificados para evaluación ambiental. Ecológico. Índico. 28, 125-141 (2013).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

van der Meer, JR y Belkin, S. Donde la microbiología se encuentra con la microingeniería: diseño y aplicaciones de bacterias reporteras. Nat. Rev. Microbiol. 8, 511–522 (2010).

Artículo PubMed Google Scholar

Sekhon, SS y cols. Biosensores de Escherichia coli específicos de estrés basados ​​en promotores de genes para el seguimiento de la toxicidad. Mol. Celúla. Toxico. 10, 369–377 (2014).

Artículo CAS Google Scholar

Van Dyk, TK y col. Las respuestas a los tóxicos de una cepa de Escherichia coli que porta una fusión genética uspA'::lux y una cepa de E. coli que porta una fusión grpE'::lux son similares. Aplica. Reinar. Microbiol. 61, 4124–4127 (1995).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Matejczyk, M., Lewandowski, W. y Rosochacki, SJE coli K-12 recA::gfp biosensor microbiano utilizado para la detección de residuos farmacéuticos anticancerígenos y antidiabéticos. Desalinización. Tratamiento de agua. 57, 1582-1592 (2016).

Artículo CAS Google Scholar

Hever, N. y Belkin, S. Una cepa indicadora bacteriana de dos colores para la detección de efectos tóxicos y genotóxicos. Ing. Ciencias de la vida. 6, 319–323 (2006).

Artículo CAS Google Scholar

McCool, JD y cols. Medición de la expresión de SOS en células individuales de Escherichia coli K-12 mediante microscopía de fluorescencia. Mol. Microbiol 53, 1343-1357 (2004).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Lacour, S. & Landini, P. Expresión del gen dependiente de σS al inicio de la fase estacionaria en Escherichia coli: función de los genes dependientes de σS e identificación de sus secuencias promotoras. J. Bacteriol. 186, 7186–7195 (2004).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Arsène, F., Tomoyasu, T. y Bukau, B. La respuesta al choque térmico de Escherichia coli. En t. J. Microbiol alimentario. 55, 3–9 (2000).

Artículo PubMed Google Scholar

Campbell, RE y cols. Una proteína fluorescente roja monomérica. Proc. Acad. Nacional. Ciencia. 99, 7877–7882 (2002).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Cormack, BP, Valdivia, RH y Falkow, S. Mutantes optimizados para FACS de la proteína verde fluorescente (GFP). Gen 173, 33–38 (1996).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Subach, OM, Cranfill, PJ, Davidson, MW y Verkhusha, VV Una proteína fluorescente azul monomérica mejorada con la alta estabilidad química del cromóforo. PLoS One 6, e28674 (2011).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Raab, D., Graf, M., Notka, F., Schödl, T. y Wagner, R. El algoritmo GeneOptimizer: uso de un enfoque de ventana deslizante para hacer frente al vasto espacio de secuencia en la optimización de secuencias de ADN multiparamétricas. Sistema. Sintetizador. Biol. 4, 215–225 (2010).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Delvigne, F., Pêcheux, H. y Tarayre, C. Bibliotecas de reporteros fluorescentes como herramientas útiles para optimizar las fábricas de células microbianas: una revisión de los métodos y aplicaciones actuales. Frente. Bioeng. Biotecnología. 3, 1–8 (2015).

Artículo de Google Scholar

Fei, Y.-Y., Gai, J.-Y. y Zhao, T.-J. Identificación de genes regulados que confieren resistencia a altas concentraciones de glifosato en una nueva cepa de Enterobacter. Microbiol FEMS. Letón. 349, 135-143 (2013).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Newmark, KG, O'Reilly, EK, Pohlhaus, JR & Kreuzer, KN Análisis genético de los requisitos para la inducción de SOS mediante ácido nalidíxico en Escherichia coli. Gen 356, 69–76 (2005).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Erill, I., Campoy, S. & Barbé, J. Eones de angustia: una perspectiva evolutiva de la respuesta SOS bacteriana. Microbiol FEMS. Rev. 31, 637–656 (2007).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Leßmeier, L. & Wendisch, VF Identificación de dos mutaciones que aumentan la tolerancia al metanol de Corynebacterium glutamicum. BMC Microbiol. 15, 216 (2015).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Dörr, T., Lewis, K. & Vulić, M. La respuesta SOS induce la persistencia de las fluoroquinolonas en Escherichia coli. PLoS Genet 5, e1000760 (2009).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Hakura, A., Mochida, H. y Yamatsu, K. El dimetilsulfóxido (DMSO) es mutagénico para cepas de prueba de mutagenicidad bacteriana. Mutación. Res. Letón. 303, 127-133 (1993).

Artículo CAS Google Scholar

Landini, P., Egli, T., Wolf, J. & Lacour, S. sigmaS, un actor importante en la respuesta al estrés ambiental en E scherichia coli: función, regulación y mecanismos de reconocimiento del promotor. Reinar. Microbiol. Representante 6, 1-13 (2014).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Miller, EN et al. El furfural inhibe el crecimiento al limitar la asimilación de azufre en la cepa etanológena de Escherichia coli LY180. Aplica. Reinar. Microbiol. 75, 6132–6141 (2009).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rutherford, BJ y cols. Estudio genómico funcional del estrés del n-butanol exógeno en Escherichia coli. Aplica. Reinar. Microbiol. 76, 1935-1945 (2010).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Van Dyk, TK y col. Detección rápida y sensible de contaminantes mediante la inducción de fusiones de genes de choque térmico y genes de bioluminiscencia. Aplica. Reinar. Microbiol. 60, 1414-1420 (1994).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Lombardo, M.-J. Regulador general de respuesta al estrés RpoS en mutación adaptativa y amplificación en Escherichia coli. Genética 166, 669–680 (2004).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Takhaveev, V. & Heinemann, M. Heterogeneidad metabólica en poblaciones microbianas clonales. actual. Opinión. Microbiol. 45, 30–38 (2018).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Dar, D., Dar, N., Cai, L. y Newman, DK Transcriptómica espacial de poblaciones de bacterias planctónicas y sésiles con resolución unicelular. Ciencia 373, eabi4882 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kanehisa, M., Furumichi, M., Sato, Y., Ishiguro-Watanabe, M. y Tanabe, M. KEGG: integración de virus y organismos celulares. Ácidos nucleicos res. 49, D545-D551 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Abdelwahed, EK, Hussein, NA, Moustafa, A., Moneib, NA y Aziz, RK Redes genéticas y vías implicadas en la respuesta de Escherichia coli a múltiples factores estresantes. Microorganismos 10, 1793 (2022).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Flemming, H.-C. et al. Biopelículas: una forma emergente de vida bacteriana. Nat. Rev. Microbiol. 14, 563–575 (2016).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Stewart, PS y Franklin, MJ Heterogeneidad fisiológica en biopelículas. Nat. Rev. Microbiol. 6, 199–210 (2008).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Hansen, SH et al. Cultivo y análisis de biopelículas asistido por máquinas. Ciencia. Rep. 9, 8933 (2019).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Serra, DO y Hengge, R. Las respuestas al estrés son tridimensionales: el orden espacial de la diferenciación fisiológica en biopelículas de macrocolonias bacterianas. Reinar. Microbiol. 16, 1455-1471 (2014).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Werner, E. y col. Crecimiento estratificado en biopelículas de Pseudomonas aeruginosa. Aplica. Reinar. Microbiol. 70, 6188–6196 (2004).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zeder, M., Ellrott, A. y Amann, R. Definición automatizada del área de muestra para microscopía de alto rendimiento. Citomo. Parte A 79A, 306–310 (2011).

Artículo de Google Scholar

Harms, A., Maisonneuve, E. & Gerdes, K. Mecanismos de persistencia bacteriana durante el estrés y la exposición a antibióticos. Ciencia 354, aaf4268 (2016).

Artículo PubMed Google Scholar

Gibson, DG y col. Ensamblaje enzimático de moléculas de ADN de hasta varios cientos de kilobases. Nat. Métodos 6, 343–345 (2009).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Schindelin, J. y col. Fiji: una plataforma de código abierto para el análisis de imágenes biológicas. Nat. Métodos 9, 676–682 (2012).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Krueger, F., James, F., Ewels, P., Afyounian, E. y Schuster-Boeckler, B. FelixKrueger/TrimGalore: v0.6.7 - DOI vía Zenodo. https://doi.org/10.5281/ZENOD.5127899 (2021).

Kopylova, E., Noé, L. y Touzet, H. SortMeRNA: filtrado rápido y preciso de ARN ribosómicos en datos metatranscriptómicos. Bioinformática 28, 3211–3217 (2012).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Dobin, A. y col. STAR: alineador universal ultrarrápido de RNA-seq. Bioinformática 29, 15-21 (2013).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Liao, Y., Smyth, GK & Shi, W. featureCounts: un programa eficiente de propósito general para asignar lecturas de secuencias a características genómicas. Bioinformática 30, 923–930 (2014).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Love, MI, Huber, W. & Anders, S. Estimación moderada del cambio de pliegue y la dispersión para datos de RNA-seq con DESeq2. Genoma Biol. 15, 550 (2014).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Equipo central R (2020). R: Un lenguaje y entorno para la informática estadística. Fundación R para Computación Estadística, Viena, Austria. https://www.r-project.org.

Hänzelmann, S., Castelo, R. y Guinney, J. GSVA: análisis de variación del conjunto de genes para datos de microarrays y RNA-Seq. BMC Bioinforma. 14, 7 (2013).

Artículo de Google Scholar

Descargar referencias

Este trabajo fue apoyado a través del programa Helmholtz “Ingeniería de Sistemas de Materiales” bajo el tema “Sistemas de Materiales Adaptativos y Bioinstructivos”. AEZ agradece al Servicio Alemán de Intercambio Académico (DAAD) y al Ministerio de Educación Superior egipcio (MOHE) por financiar su beca de doctorado. Agradecemos a Tim Scharnweber, Minja Celikic y Yong Hu por su ayuda con las imágenes CLSM.

Financiamiento de Acceso Abierto habilitado y organizado por Projekt DEAL.

Instituto de Interfaces Biológicas 1 (IBG-1), Instituto Tecnológico de Karlsruhe (KIT), Eggenstein-Leopoldshafen, Alemania

Ahmed E. Zoheir, Laura Meisch, Christof M. Niemeyer y Kersten S. Rabe

Departamento de Genética y Citología, Centro Nacional de Investigación (NRC), El Cairo, Egipto

Ahmed E. Zoheir

Instituto de Interfaces Biológicas 5 (IBG-5), Instituto Tecnológico de Karlsruhe (KIT), Eggenstein-Leopoldshafen, Alemania

Morgan S. Sobol y Anne-Kristin Kaster

Laboratorio Europeo de Biología Molecular (EMBL), Instalación Central de Citometría de Flujo, Heidelberg, Alemania

Diana Ordoñez-Rueda

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

AEZ, CMN y KSR conceptualizaron la investigación. AEZ llevó a cabo todos los experimentos de ingeniería genética, ensayos de estrés y biopelículas y analizó todos los datos respectivos. DOR y AEZ realizaron el análisis FACS. MSS realizó el análisis transcriptómico. LM realizó experimentos de estabilidad de plásmidos y analizó sus datos. AEZ, MSS, DO, AKK, CMN y KSR escribieron el manuscrito. Todos los autores revisaron y aprobaron el manuscrito.

Correspondencia a Kersten S. Rabe.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso Abierto Este artículo está bajo una Licencia Internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, compartir, adaptación, distribución y reproducción en cualquier medio o formato, siempre y cuando se dé el crédito apropiado a los autores originales y a la fuente. proporcione un enlace a la licencia Creative Commons e indique si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la normativa legal o excede el uso permitido, deberá obtener permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Zoheir, AE, Sobol, MS, Meisch, L. et al. Un biosensor de estrés de tres colores revela la respuesta multimodal en células individuales y la dinámica espaciotemporal de las biopelículas. npj Biofilms Microbiomes 9, 57 (2023). https://doi.org/10.1038/s41522-023-00424-1

Descargar cita

Recibido: 14 de enero de 2023

Aceptado: 31 de julio de 2023

Publicado: 21 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41522-023-00424-1

Cualquier persona con la que comparta el siguiente enlace podrá leer este contenido:

Lo sentimos, actualmente no hay un enlace para compartir disponible para este artículo.

Proporcionado por la iniciativa de intercambio de contenidos Springer Nature SharedIt